糖尿病患降低體內氧化壓力、降低血糖減少體內細胞發炎可有效避免感染冠狀病毒後重症、死亡
科技部補助產學合作研究計畫成果完整(進度)報告
開發鯽魚複方製劑為抗高脂飲食引發代謝症候群之研究
計畫類別：□ 先導型 □ 開發型 ■ 技術及知識應用型
計畫編號：NSC102－2622－B －040－002－CC3
執行期間： 102 年 6 月 1 日 至 103 年 5 月 31 日
執行單位：中山醫學大學 營養學系(所)
計畫主持人：陳璟賢
共同主持人：徐成金
計畫參與人員：李亞樺、蕭亭萱
處理方式：
1.公開方式：
□不予公開
公開(如有企業配合款 (如有企業配合款，須與合作企業商議同意 ，須與合作企業商議同意)：
□立即公開
□1 年後公開
■2 年後公開
2.本研究是否有嚴重損及公共利益之發現 2.本研究是否有嚴重損及公共利益之發現：■否□是
3.本報告是否建議提供政府單位參考 3.本報告是否建議提供政府單位參考□否■是，衛福部（請列舉提供之單位 （請列舉提供之單位；本部
不經審議，依勾選逕予轉送 ，依勾選逕予轉送。）
中 華 民 國 103 年 8 月 31 日
目錄
(一)中文摘要及關鍵詞………………………………………………………………………………Ⅰ
(二)英文摘要及關鍵詞………………………………………………………………………………Ⅱ
(三)報告內容：
前言……………………………………………………………………………………………… 1
研究目的………………………………………………………………………………………… 4
文獻探討………………………………………………………………………………………… 4
研究方法………………………………………………………………………………………… 5
結果與討論……………………………………………………………………………………… 13
參考文獻………………………………………………………………………………………… 17
附圖……………………………………………………………………………………………… 21
計畫成果自評…………………………………………………………………………………… 36
附錄……………………………………………………………………………………………… 38
(一)中文摘要及關鍵詞
代謝症候群(metabolism syndrome)是一種包含肥胖、血壓偏高、血糖偏高以及血脂異常等多項危險因子
綜合表現的臨床徵候，伴隨著這些危險因子的增加，罹患心血管疾病、糖尿病和脂肪肝也相對提升。這三
個代謝性疾病已被證明可用飲食來控制，因此利用健康食品來預防或改善代謝症候群應有其發展的可行
性。鯽魚複方製劑(Carassius auratus complex formula，CACF)是以鯽魚與山藥、枸杞、熟地黃等中藥熬製而
成的傳統中藥配方，在中國已應用於治療糖尿病。本實驗分別利用氧化壓力 H2O2引發胰島β細胞衰竭之細
胞模式，以及高脂飲食(high fat diet，HFD)合併 streptozotocin (STZ)誘發代謝症候群之動物模式，分析 CACF
對於代謝症候群之影響。在細胞實驗中發現，CACF 經由增加 PI3K、NF-κB 與 IRS-2 等蛋白表現，保護大
鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)對抗 H2O2 刺激下所導致細胞凋亡(apoptosis)和活性氧(reactive oxygen
species，ROS)的產生。CACF 也能夠促使 RIN-m5F 細胞胰島素分泌逐漸回升，且增加胰島素分泌相關基因
(包含 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2)表現。在動物實驗中，評估代謝症候群症狀方面以體重、腹部脂肪堆
積及副睪脂肪含量作為肥胖指標；以血糖、血清胰島素、HOMA-IR 及 OGTT 血糖變化評估是否胰島素阻
抗；以及分析血清中發炎激素及脂肪細胞激素濃度；另測量肝臟抗氧化相關指標(TBARS、GSH、GPx)，
並以 H&E 染色觀察肝臟和腎臟當中異常組織型態變化。結果顯示 CACF 試驗組之動物胰島素阻抗表現比
HFD 合併 STZ 誘導組減少許多；並發現 CACF 可抑制由 HFD 合併 STZ 所誘導血清中 TNF-α、IL-6 及 leptin
之分泌量。隨著 CACF 處理劑量增加對於各組織脂質過氧化表現、肝臟脂肪堆積、腎臟發炎細胞浸潤及蛋
白尿現象也都有減緩之趨勢。由以上實驗結果顯示，CACF 具有保護胰島β細胞衰竭作用、以及極佳的降血
脂、抗氧化和抗發炎活性，並能抑制代謝症侯群之表徵。
關鍵詞：代謝症候群、鯽魚複方製劑、胰島β細胞、細胞凋亡、抗氧化、胰島素阻抗、降血脂、抗發炎、鯽魚複方免疫製劑
(二)英文摘要及關鍵詞（keywords）
Metabolic syndrome is characterized by obesity, hypertension, hyperglycemia and dyslipidemia as well as a
cluster of risk factors. Along with these risk factors rising, the probability of suffering from cardiovascular disease,
diabetes and fatty liver would be increased. Carassius auratus complex formula (CACF), including Carassius
auratus, Rhizoma dioscoreae, Lycium chinense, and Rehmannia glutinosa Libosch, is a combination prescription
of traditional Chinese medicine, which always has been used to treat diabetes in ancient China. Thus, this study
aimed to study the effect of CACF on anti-metabolic syndrome. In vitro study, CACF improved the survival of
RIN-m5F, an insulin-producing cell line derived from rat insulinoma tissue, from H2O2-induced viability loss. In
addition, H2O2-induced the occurrence of apoptosis and the production of reactive oxygen species (ROS) were
reduced by CACF. Molecular data showed that protective effect of CACF might be mediated via up-regulation of
PI3K, NF-κB and IRS-2. CACF also reversed insulin secretion, and increased the mRNA levels of insulin
secretion-related genes, including PDX-1, GK, GLUT-2 and IRS-2. In vivo study, the mice were fed high fat diet
(HFD) combined streptozotocin (STZ) supplemented with CACF (30 mg/kg and 150 mg/kg) for 8 weeks. To
analyze metabolic syndrome, body weight and epididmyal fat accumulation were used as indicators of obesity.
Fasting serum glucose, insulin, HOMA-IR, and oral glucose tolerance (OGTT) were used as indicators of insulin
resistance. For exploring the possible mechanism for diet-induced metabolic syndrome, adipocytokines (leptin and
adiponectin) and proinflammatory factors (TNF-α and IL-6) were measured in serum, as well as the presence of fat
droplets and peri-portal fibrosis in liver was examined histologically. Feeding CACF to mice significantly reduced
these hallmarks of metabolic syndrome induced by HFD combined STZ treatment. CACF improved metabolic
syndrome in vivo via possessing hypoglycemic, hypolipidemic, antioxidant and anti-inflammatory activities. These
results suggested that CACF potentially could be developed as an anti-metabolic syndrome agent and deserve
further investigation.
Keywords: metabolic syndrome, Carassius auratus complex formula, insulin-producing cell line, apoptosis, insulin
resistance, hypoglycemic, hypolipidemic, antioxidant, anti-inflammatory.
(三)報告內容：
前言、
一、 代謝症候群（Metabolism syndrome）
代謝症候群是一種包含肥胖、血壓偏高、血糖偏高以及血脂代謝異常等多項危險因子綜合表現的臨床
徵候，伴隨著這些危險因子的增加，罹患心血管疾病（cardiovascular diaease）、糖尿病（diabetes mellitus, DM）
和脂肪肝（fatty liver）也相對提升。在 1980 年代，對於這種結合心血管疾病和代謝失常的症候群有〝X 症
候群（X syndrome）〞和〝胰島素抗性症候群（insulin resistance syndrome）〞等不同的名稱(1, 2)。於 1998 年，
世界衛生組織（WHO）率先提出代謝症候群的定義，認為胰島素阻抗（insulin resistance）是該病症最重要
的指標，另外合併以下指標兩項及以上者，即為代謝症候群；這些指標包括肥胖（男性腰臀比大於 0.9，女
性腰臀比大於 0.85；或 BMI 在 30 以上者）；血壓大於 140/90 mmHg)；脂質代謝異常﹝三酸甘油酯
（triglycerides, TG）大於 150 mg/dL 或高密度脂蛋白（high density lipoprotein, HDL）過低：男性低於 35
mg/dL，女性低於 45 mg/dL﹞；微蛋白尿(3)。國內現行代謝症候群之判定標準（依據 2007 年衛生署國民
健康局公告版）共列腰圍、血壓、空腹血糖濃度、三酸甘油酯及高密度脂蛋白膽固醇等 5 項危險因子，符
合其中 3 項即認定為代謝症候群患者。據當年度台灣地區高血壓（hypertensin）、高血糖（hyperglycemia）、
高血脂（hyperlipidemia）之追蹤調查研究顯示：國人代謝症候群盛行率：20 歲以上為 19.7%（男 20.3%，
女 19.3%），且隨年齡上升而有增加的趨勢。代謝症候群的危險性來自於它與第 2 型糖尿病及心血管疾病
發生的危險因子具高度關聯性，而胰島素阻抗及第 2 型糖尿病又會加速粥狀動脈硬化（atherosclerosis）發
生，因而目前備受醫學界矚目。研究指出，患有代謝症候群之非糖尿病患者日後罹患第 2 型糖尿病的機率
較正常人增加 4 倍，罹患心血管疾病的危險性則增加 30% (4)。代謝症候群的形成機制雖未完全釐清，但
主要因素在於肥胖與胰島素阻抗，而產生葡萄糖及脂肪代謝的異常，進而衍生出上述各種疾病。一般認為
胰島素阻抗是所有症狀之間的共同連結因子，故目前研究多著重在阻抗的發生與血糖的恆定及心血管疾病
發展間的關係。此外，脂質異常（lipid disorder）及發炎現象也被認為是導致代謝症候群的主要機制之一(5,
6)。代謝症候群的成因可能與先天遺傳及人口學等生物因素有關，但最重要的還是不活動或少活動生活型
態、肥胖人口增加、生活壓力及其他不良健康行為等因素所造成。在治療代謝症候群相關疾病之藥品方面，
如 statin 等具有 3-hydroxy-3-methylglutaryl (HMG)-Coenzyme A (CoA) reductase 抑制作用之藥物常被用於
降低患者血清中膽固醇(7)；而可增加高密度脂蛋白膽固醇之 niacin 皆為目前治療及研究之主流(8)。但目前
這類上市藥物具有體重增加，肝毒性和心臟衰竭等副作用，因此開發有效且安全以防治代謝症候群的天然
食材備受重視。綜合上述，代謝症候群的成因主要由胰島素阻抗、脂質異常及動脈粥狀硬化所組成。其中
胰島素阻抗是代謝症候群的初期症徵，也被認為是第 2 型糖尿病發生的前兆。
1.1. 胰島素阻抗（insulin resistance）
胰島素（insulin）是由胰臟蘭氏小島中的β-細胞所產生的蛋白質。胰島素參與體內許多重要的恆定，
其中最重要的角色之一就是調節葡萄糖的恆定（glucose homeostasis）。當血漿中葡萄糖濃度上昇時，就會
刺激胰島素分泌以增加細胞及周邊組織對葡萄糖的攝取、增加肝醣的合成、抑制肝醣分解及糖質新生作用，
最後使血糖恢復至正常範圍。第 2 型糖尿病則肇因於肌肉組織、脂肪組織、肝臟等對胰島素失去正常的敏
感性，也就是對正常濃度的胰島素的反應降低，導致這些組織該進行的降血糖活動效率不彰，血糖濃度因
此偏高。這個對胰島素失去敏感性的現象，稱為胰島素阻抗(9)。胰島素是靠著活化細胞中的上述一系列生
化反應來產生降血糖的效果，這一系列的生化反應稱為胰島素訊息傳遞路徑。而發炎性的細胞激素 IL-1β
（interleukin-1 beta）、IL-6 及 TNFα（tumor necrosis factor-alpha）在誘導細胞發炎時，也抑制了胰島素訊
息傳遞路徑中的生化反應。因此發炎性細胞激素對肝臟、肌肉及脂肪組織的刺激，阻斷了胰島素活化胰島
素訊息傳遞路徑的能力，使細胞失去對胰島素的敏感性，這就是胰島素抗性的禍首。更廣義而言，周邊胰
島素阻抗是指體內的目標細胞對於胰島素有一個不正常較低的反應，而胰島素的阻抗也包含了血漿中有較
高的胰島素濃度及高三酸油酯血症(10)。在評估代謝症候群症狀方面以體重及腹部脂肪堆積作為肥胖（特
別是中央型肥胖）指標；以血糖、血清胰島素、口服葡萄糖耐受試驗（Oral Glucose Tolerance Test, OGTT）
及胰島素耐量試驗（insulin tolerance test, ITT）血糖變化以評估是否胰島素阻抗；並量測血脂質（TG 及 total
cholesterol, TC）及血壓。胰島素阻抗的出現是第 2 型糖尿病發生的前兆；隨著病程演進，其胰島素分泌逐
漸降低，最後可能會出現胰臟β-細胞衰竭（β- cell failure）。所以在胰島素抗性發展的初期，若能及早發
現並積極治療，將有助於避免代謝症候群以及第 2 型糖尿病的形成。
二、 抗代謝症候群機制
2.1. 調節胰島素訊息傳遞路徑（Regulation of insulin signaling）
胰島素阻抗被認為是形成代謝症候群的主要機制，因此能增進胰島素敏感之物質將有機會預防或改善
代謝症候群。胰島素致敏物具有調節胰島素訊息傳遞路徑（insulin signaling）之活性(11)。此胰島素訊息傳
遞路徑起始於胰島素作用於細胞膜上的胰島素受器（insulin receptor）。胰島素受器廣泛分佈於脊椎動物的
細胞上，但依細胞種類不同而有數量上的差異(12)。此受器由膜內及膜外兩部分組成，膜外是由 2 個含有
胰島素結合位（binding site）的α次單元構成；而膜內則包含 2 個穿膜結構及具有酪胺酸蛋白激酶（tyrosine
protein kinase）活性的β次單元構成。酪胺酸蛋白激酶的活性對胰島素的作用扮演關鍵角色。先前研究發
現，當缺乏胰島素受器的老鼠會在出生後極短的時間內死亡，而在人類身上則可存活一段時間但仍會伴隨
有嚴重的生長遲滯及糖尿病發生(13,14)。因此胰島素受器的完整性對胰島素訊息路徑的活化佔有重要的影
響力。當胰島素接上其受器之後，會活化酪胺酸蛋白激酶的活性造成自己本身β次單元的自磷酸化
（auto-phosphorylation），之後進而磷酸化胰島素接受器受質-1（insulin receptor substrate, IRS）蛋白，而 IRS
也扮演重要的平台以提供胰島素受器及其下游訊息路徑分子之間的溝通橋樑。到目前為止，研究發現哺乳
動物中具有 IRS-1~4 四種蛋白。IRS-1 主要與體細胞的生長及對肌肉和脂肪組織的胰島素作用有關(15)。
IRS-2 則是與胰臟β-細胞的存活與生長有關及對肝臟、大腦生長、生殖系統和食物攝取的情況下胰島素的
作用有關(15, 16)。另外 IRS-3 及 IRS-4 則主要表現在脂肪組織及神經內分泌組織中且其功能方尚待更多的
實驗證實。而以基因剔除（gene knockout）的方式之實驗中發現 IRS-1 及 IRS-2 與訊息路徑之活化有關。
在 IRS-1 缺乏的小鼠身上，發現小鼠會在胚胎及出生之後發生明顯的生長缺陷；但是儘管有胰島素抗性的
發生，IRS-1 缺乏的小鼠卻不會發展成糖尿病，因其體內可藉由代償性的增加胰島素的分泌(17)。相反地，
如果阻斷了 IRS-2 則會導致小鼠嚴重的糖尿病，並且使公的小鼠在幼年時期即死亡(18)。在利用血糖鉗定術
（euglycemic-hyperinsulinemic clamp）的實驗中發現缺乏 IRS-1 及 IRS-2 的小鼠身上，IRS-2 在肝臟、肌肉
和脂肪組織扮演多樣角色，而 IRS-1 的代謝調節功能則侷限於在骨骼肌上(19)。因此 IRS-2 在胰島素阻抗的
發生及胰臟β-細胞的功能不良上扮演關鍵角色，也將會是測量上的一個重要指標。而在胰島素活化訊息路
徑中，IRS 蛋白位於較早的階段；所以在胰島素刺激後，透過 IRS 蛋白進而活化路徑下游的訊息分子；其
中包括 PI3K（phosphatidylinositol 3-kinase）、PKB（Protein kinase B）/Akt 及 MAPK（mitogen-activated protein
kinases）等。在胰島素刺激下，透過 PI3K 途徑可藉由增加葡萄糖運輸蛋白（glucose transporter, GLUT4 和
GLUT1）的表現及細胞內的轉位來增加骨骼肌及脂肪組織中對葡萄糖的利用率，以達到降低血糖的目的
(20)。而在胰臟β-細胞中，PI3K/Akt 路徑的活化則可促進β-細胞的存活及生長(21)。
2.2. 抗氧化及抗發炎作用（Antioxidant and anti-inflammation）
由於氧化壓力（oxidative stress）與許多疾病的發展有關，目前認為氧化壓力影響胰島素功能的機制之
一，原因可能在於自由基（reactive oxygen species, ROS）的產生改變了細胞膜的結構與流動性(22, 23)，特
別是胰臟β細胞，因為β細胞比其他組織細胞對於自由基更敏感，容易受到攻擊而導致胰島素分泌受損
(24)。研究亦指出當胰島素代謝不平衡時，可能造成血中游離脂肪酸濃度升高，而當脂肪酸濃度超過肝臟
代謝能力時，會造成體內脂質的堆積增加，並促進體內脂質過氧化物和 ROS 產生，而造成氧化壓力上升，
血脂異常等負面的影響。血液中有過多的游離脂肪酸也會影響胰島素的訊號傳遞，更加重胰島素阻抗(25)。
這些 ROS 主要源自於脂肪組織會分泌許多具生物活性的特異蛋白質，稱之為脂肪細胞激素
（adipocytokines）(26)。脂肪細胞激素包含有 adiponectin、TNF-α 及 leptin 等。在基因缺陷肥胖鼠 obese
KKAy mice 也可觀察到隨著體重的增加，氧化壓力也隨之上升，可能負責產生過氧化物質的 NADPH 氧化
酶（NADPH oxidase）過量表現、以及抗氧化酵素的活性降低有關。以氧化劑 H2O2 處理脂肪細胞 3T3-L1 發
現會使細胞激素的表現失調，包括降低 adiponectin 及 PPAR-γmRNA，及增加 IL-6 及 MCP-1 mRNA。若
培養液中同時添加抗氧化劑 N-acetylcysteine，則可回復這些細胞激素表現異常的現象。此抗氧化劑也可修
正因 TNF-α 誘發所造成的 3T3-L1 脂肪細胞激素 IL-6、IL-1β分泌增加及 adiponectin 分泌減少的異常情
況。N-acetylcysteine 透過抑制轉錄因子 NF-κB 的活化，使得這些脂肪細胞激素的分泌能朝向對健康有正
面影響的方向(40)。綜合上述，腹部脂肪組織的發炎反應與氧化壓力，使得脂肪細胞激素分泌異常（增加
前發炎細胞激素，而降低 adiponectin 的分泌），是造成胰島素阻抗的關鍵病理過程。因此，透過飲食攝取
豐富的抗氧化及抗發炎物質，減輕因肥胖引起的氧化壓力與發炎反應，修正細胞激素分泌異常的狀況，應
可改善胰島素阻抗作用，作為預防代謝症候群發生的可行的飲食保健策略。目前研究已顯示於飲食中多攝
取抗氧化物質有助於預防代謝症候群，進而降低心血管疾病的發生(27)。許多新近研究提出 PPARγ 拮抗
劑具有成為胰島素致敏物及抗發炎藥物的潛能。而一些 n-3 不飽和脂肪酸及食物成分則已經被證實可藉由
活化 PPARγ 來改善胰島素的敏感性(28)。綜合上述得知，具有抗氧化且抗發炎等功效的天然物可能具有
改善代謝症候群之功效，然研究至今，開發改善代謝症候群之天然物質仍缺乏，且其機制仍在探討中。
三、鯽魚複方製劑過去研究
本實驗室先前已完成的動物實驗中發現鯽魚複方製劑對 STZ 誘發第 1 型糖尿病小鼠的高血糖具有下降
的作用。而在以 STZ 誘發之第 2 型糖尿病模式中，鯽魚複方製劑對第 2 型糖尿病所造成的胰島素阻抗及葡
萄糖耐受不良也具有改善的情形。因此本次研究之重點是想要更進一步瞭解鯽魚複方製劑對改善第 1 型及
第 2 型糖尿病的機轉及其所影響之相關路徑活化情形。故我們假設胰臟β-細胞的失效將會導致第 2 型糖尿
病的發生，所以我們將以不同的胰臟β-細胞(胰島素分泌型細胞(INS-1)及人類胰臟細胞株 PANC1)為研究模
式並作為對照，觀察當胰臟β-細胞處於高糖及高氧化壓力的環境下，β-細胞的凋亡(apoptosis)情形是否因
此增加導致β-細胞的存活下降、降低β-細胞的質量使得胰島素分泌量下降無法發揮正常功能。另外其相
關轉錄因子 NF-κB 及 PI 3-kinase 路徑的活化是否受到影響將一併討論。當在此不利的生理壓力條件下，
於細胞培養液中添加鯽魚複方製劑共同培養或預培養之後，是否可下降胰臟β-細胞凋亡的作用的發生及對
胰臟β-細胞具有保護的作用。更進一步觀察，目前許多研究指出代謝症候群(metabolic syndrome)可能會導
致第 2 型糖尿病與心血管疾病的發生。代謝症候群指的是一群與心血管及代謝相關的危險因子的集合症
狀，其包括：高血糖（hyperglycemia）、血脂異常（dyslipidemia）、血壓昇高（elevation of blood pressure）、
腹部肥胖(abdominal obesity)及胰島素阻抗(insulin resistance)等症狀。因此血脂的控制不良、過多的游離脂
肪酸產生、胰島素阻抗的發生都會加速第 2 型糖尿病的發生。故我們假設是否能透過對於代謝症候群的早
期有效預防而達到延緩及預防第 2 型糖尿病的發生的作用。
研究目的、
先前的研究已知鯽魚複方製劑對第 1 及第 2 型糖尿病具有保護的作用，包括：
1. 鯽魚複方製劑具有幫助對於第 1 型糖尿病老鼠血糖控制的效果。
2. 在血脂部分，鯽魚複方製劑顯示對於正常老鼠與誘發第 1 型及第 2 型糖尿病鼠的血清中 TG 均有下降
作用。
3. 鯽魚複方製劑對於體內的抗氧化環境有實質的幫助，不僅對血漿中的 TBAR 值(代表氧化壓力)有下降
作用，且對於肝臟中的抗氧化酵素活性也具有節省作用(sparing)，可減少其活性受損下降。
4. 鯽魚複方製劑對於腎臟中的醛糖還原酶具有下降作用，有助於延緩腎臟中糖尿病併發症的發生。
此外，從我們的預實驗中也發現餵食誘發肥胖小鼠鯽魚複方製劑後，也可以有效下降肝臟中 TG 的堆
積、副睪脂肪重和胰島素阻抗指數。因此我們推測鯽魚複方製劑中所含有的成分可能對於胰臟β-細胞具有
保護的作用及抗代謝症候群的效應，將進一步研究證實。
因此本計畫的目標就是要瞭解其機轉，包括其相關轉錄因子 NF-κB 及 PI 3-kinase 路徑的活化是否受
到影響及在高脂飲食下抗代謝症候群的效應，將進一步討論之。並且透過良利生物科技有限公司所提供之
鯽魚複方製劑產品，將有助於使鯽魚水萃物之標準化，有利於實驗之進行。
文獻探討、
1. 2007 年台灣地區高血壓（hypertensin）、高血糖（hyperglycemia）、高血脂（hyperlipidemia）之追蹤調查
研究顯示：國人代謝症候群盛行率：20 歲以上為 19.7%（男 20.3%，女 19.3%），且隨年齡上升而有增加的
趨勢。
2. 研究指出，患有代謝症候群之非糖尿病患者日後罹患第 2 型糖尿病的機率較正常人增加 4 倍，罹患心血管疾病的危險性則增加 30% (4)。
3. 脂質異常（lipid disorder）及發炎現象也被認為是導致代謝症候群的主要機制之一(5, 6)。
4. 在治療代謝症候群相關疾病之藥品方面，如 statin 等具有 HMG-CoA reductase 抑制作用之藥物常被用於
降低患者血清中膽固醇(7)；而可增加高密度脂蛋白膽固醇之 niacin 皆為目前治療及研究之主流(8)。但目前
這類上市藥物具有體重增加，肝毒性和心臟衰竭等副作用，因此開發有效且安全以防治代謝症候群的天然
食材備受重視。
5. 胰島素接受器受質-2（insulin receptor substrate-2, IRS-2）蛋白與胰臟β-細胞的存活與生長有關(15)。所
以在胰島素刺激後，透過 IRS 蛋白進而活化路徑下游的訊息分子；其中包括 PI3K（phosphatidylinositol
3-kinase）、PKB（Protein kinase B）/Akt 及 MAPK（mitogen-activated protein kinases）等。在胰島素刺激下，
透過 PI3K 途徑可藉由增加葡萄糖運輸蛋白（glucose transporter, GLUT4 和 GLUT1）的表現及細胞內的轉
位來增加骨骼肌及脂肪組織中對葡萄糖的利用率，以達到降低血糖的目的(20)。而在胰臟β-細胞中，
PI3K/Akt 路徑的活化則可促進β-細胞的存活及生長(21)。
6.目前認為氧化壓力影響胰島素功能的機制之一，原因可能在於自由基（reactive oxygen species, ROS）的
產生改變了細胞膜的結構與流動性(22, 23)，特別是胰臟β細胞，因為β細胞比其他組織細胞對於自由基更
敏感，容易受到攻擊而導致胰島素分泌受損(24)。研究亦指出當胰島素代謝不平衡時，可能造成血中游離
脂肪酸濃度升高，而當脂肪酸濃度超過肝臟代謝能力時，會造成體內脂質的堆積增加，並促進體內脂質過
氧化物和 ROS 產生，而造成氧化壓力上升，血脂異常等負面的影響。血液中有過多的游離脂肪酸也會影
響胰島素的訊號傳遞，更加重胰島素阻抗(25)。這些 ROS 主要源自於脂肪組織會分泌許多具生物活性的特
異蛋白質，稱之為脂肪細胞激素（adipocytokines）(26)。脂肪細胞激素包含有 adiponectin、TNF-α 及 leptin
等。
7. 以氧化劑 H2O2處理脂肪細胞 3T3-L1 發現會使細胞激素的表現失調，包括降低 adiponectin 及 PPAR-γ
mRNA，及增加 IL-6 及 MCP-1 mRNA。若培養液中同時添加抗氧化劑 N-acetylcysteine，則可回復這些細
胞激素表現異常的現象。此抗氧化劑也可修正因 TNF-α 誘發所造成的 3T3-L1 脂肪細胞激素 IL-6、IL-1
β分泌增加及 adiponectin 分泌減少的異常情況。N-acetylcysteine 透過抑制轉錄因子 NF-κB 的活化，使
得這些脂肪細胞激素的分泌能朝向對健康有正面影響的方向(40)。
7. 許多新近研究提出 PPARγ 拮抗劑具有成為胰島素致敏物及抗發炎藥物的潛能。而一些 n-3 不飽和脂肪
酸及食物成分則已經被證實可藉由活化 PPARγ 來改善胰島素的敏感性(28)。
8. 鯽魚複方製劑由鯽魚與山藥、枸杞、熟地黃等食藥材燉煮而成，過去研究也發現，山藥、枸杞、熟地黃
皆有改善血糖功效(37-39)。
9. 本實驗室先前已完成的動物實驗中發現鯽魚複方製劑對STZ誘發第1型糖尿病小鼠的高血糖具有下降的
作用。而在以 STZ 誘發之第 2 型糖尿病模式中，鯽魚複方製劑對第 2 型糖尿病所造成的胰島素阻抗及葡萄
糖耐受不良也具有改善的情形。
研究方法、
一、細胞實驗
本研究的第一部份就是想要進一步證實鯽魚複方製劑對改善第 1 型及第 2 型糖尿病的機轉及其相關路
徑之活化情形。故我們假設胰臟β-細胞的失效將會導致糖尿病的發生，所以我們將以不同的胰臟β-細胞
(PANC1、INS-1)為研究模式並作為對照，觀察鯽魚複方製劑對改善人類及大鼠的胰臟β-細胞的作用是否一
致及對於葡萄糖刺激下胰島素的分泌作用的恢復情形。同時也將觀察當胰臟β-細胞處於高糖(16.7 or 33.3
mM)(29)及高氧化壓力(H2O2)的環境下，β-細胞的凋亡(apoptosis)情形是否因此增加導致β-細胞的存活下
降、降低β-細胞的質量使得胰島素分泌量下降無法發揮正常功能。另外其相關轉錄因子 NF-κB 及 PI
3-kinase 路徑的活化是否受到影響將一併討論。所以在此不利的生理壓力下，於細胞培養液中添加鯽魚複
方製劑共同培養或預培養之後，是否可下降胰臟β-細胞凋亡的作用的發生及對胰臟β-細胞具有保護的作
用，而同時在胰島素的作用上，是否也也可以透過對 IRS-2 途徑的改善作用來達成。
§ 測定之項目
1. 胰臟β-細胞存活分析(MTT assay)
1.1.原理：細胞內存在於粒腺體內膜中的琥珀酸去氫酶（succinate dehydrogenase）能充分將 MTT 黃色水溶
液還原為紫色結晶顆粒；而還原能力的強弱可代表琥珀酸去氫酶的活性，即粒腺體的生理狀況。粒腺體是
細胞中對於環境因素最為敏感的胞器，代表細胞的生理狀況。當琥珀酸去氫酶的還原能力強，表示克氏循
環（Kreb’s cycle）進行速率快，可產生較多的能量供給細胞代謝，故可以代表細胞的存活情形。
1.2.步驟：將細胞分盤至 96-well plate(2x104/well) ，依不同條件處理細胞至時間點，再加入 20 μl /well 之
MTT 溶液。 放入 37℃，5﹪CO2 的細胞培養箱中培養 3 小時，取出 96-well plate，加入 200 μl /well 的
DMSO 並以震盪器震動 10 分鐘，使 MTT 結晶完全溶解呈紫色。以 450 nm 波長測吸光值。
2. 胰島素的釋放及含量測試(GSIS)
2.1.原理：利用葡萄糖給予下刺激細胞，觀察胰島素的分泌情形。
2.2.步驟：參考 Winzell（2006）等人的方法加以修正，細胞依各組的不同條件培養三天後，吸除細胞培養
液並以 PBS 溫和清洗，以含 2.8mM glucose 的 Krebs Ringer buffer （簡稱 KRB，含 120 mM NaCl，5 mM
NaHCO3,，5mM KCl，1.2 mM KH2PO4，2.5 mM CaCl2，1.2 mM MgSO4，10 mM HEPES(pH 7.2)，0.2% fatty
acid free bovine albumin）預培養 1 小時後吸除，接著 control 組與低糖刺激組以含 2.8mM glucose 的 KRB
buffer 培養，高糖刺激組以含 16.7mM glucose 的 KRB buffer 培養 1 小時，最後收集 KRB buffer 進行胰島素
含量分析。
3. 偵測胰臟β-細胞內 ROS 的形成
3.1.步驟:將長滿後的細胞分盤至 6 well 細胞培養盤中，種植的細胞數約 2~4x105cells/well。以 10﹪ FBS
medium 培養 24 hr 後，再以含不同濃度鯽魚複方製劑的 medium 處理細胞至時間點並以高糖及高氧化壓力
誘發。以 Trypsin-EDTA 收集細胞，離心 1200 rpm;10 min 去上清液，加 PBS 重新混懸細胞，並再次以 1200rpm;10 min 離心。最後加入螢光染劑，以流式細胞儀觀察。
4. 胰臟β-細胞 IRS-2 及 PI-3 Kinase 之測定
經總蛋白質測定，固定樣本的蛋白量，進行 12% SDS-PAGE 電泳分析，將樣本加入 1/4 的 sample buffer，
以 95℃煮沸 5 分鐘後再冷卻 5 分鐘，注入 SDS 膠體，電泳條件為 80V/40 分鐘→110V/70 分鐘，再將跑
完電泳的 SDS-PAGE 以 110V/90 分鐘轉漬至 NC paper。完成後取出 NC peper 利用 wash buffer(含 0.1%
Tween-20 的 PBS)洗淨 5 分鐘重複 3 次，加入 5% blocking buffer(2g 脫脂奶粉溶於 40mlwash buffer)於室溫
下慢速搖擺 2 小時。之後以 wash buffer 洗淨，再加入用 wash buffe 稀釋 1000 倍的 rabbit polyclonal to IRS-2
及 PI-3 Kinase，於 4℃慢速搖晃 overnight。隔天以 wash buffe 稀釋 10000 倍的 goat anti rabbit IgG horseradish
peroxidase conjugated affinity purified antibody 於室溫慢速搖擺 2 小時後，再用 wash buffe 洗淨，利用 ECL
kit 呈色。不同樣本經由 FUJIFILN LAS-1000 冷光螢光影像分析系統分析，計算面積大小即可得知差異。
5. 轉錄因子 NF-κB 活化測試。
5.1.萃取核蛋白
5.1.1.步驟:將細胞培養於 10 cm dish 中，待長滿，加入含不同濃度鯽魚複方製劑的 medium 處理細胞至時間
點並以高糖及高氧化壓力誘發。然後以 Trypsin-EDTA 收集細胞至 15 ml 離心管中，離心 1200xg 10 min 去
上清液，加入含有 phosphatase inhibitor 的 PBS 重新混懸細胞，再次離心，以 hypotonic buffer 輕輕混懸細胞
並轉至 eppendorf，冰浴 15 分鐘，再加入 detergent 高速 vortex 10 秒，之後 14000xg 4℃; 30 sec 超高速離心，
收集 pellet 進一步萃取核蛋白。以 lysis buffer 再次混懸 pellet，放入水平振盪器 100xg 30 分鐘，最後超高速
離心 14000xg 10 min，取上清液至新 eppendorf，均分或保存於-80℃直至實驗。
5.2.轉錄因子 NF-κB 活化測試
步驟:先行定量萃得的核蛋白，取一定量溶於 lysis buffer 中，加入預先固定化 NF-κB consensus
oligonucleotide 的 well 中，在水平振盪器中輕輕振盪 1 hr，再以 washing buffer 清洗 3 次，之後再依序加入
1°及 2°抗體，最後加入呈色劑反應 5 min 後終止反應。在波長 450 nm 測吸光值。
6. 胰臟β-細胞胰島素分泌相關基因(PDX-1、GK、GLUT-2、IRS-2)表現。
6.1.Total RNA 的萃取
6.1.1 步驟:將細胞培養在 6 well 細胞培養盤中，種植細胞數約 2～4 x105 cells/well，經不同組別處理後，將
細胞以 Trypsin-EDTA 刮下後，再加入含有 1 ml Trizol reagent，並靜置於冰上 5 分鐘。而後各管再加入 200
μl CHCl3，震盪混合 15 秒後於冰上靜置 15 分鐘，再在 4℃下離心 12000xg 15 分鐘，小心吸取上清液 600
μl，移至新的 1.5 ml 微量離心管中。加入 500 μl 2-propanol 上下倒置混合完全靜置冰上 10 分鐘，再在 4
℃下離心 12000xg 10 分鐘。倒去上清液，留下底部白色沉澱物。加 l ml 70﹪alcohol 脫水，並在 4 ℃下離
心 7500xg 5 分鐘。倒掉或吸乾多餘酒精，再加入適量(10~40 μl) DEPC-treat H2O，將 RNA 沉澱物溶解，並保存於-80 ℃。
6.2.RNA 定量
6.2.1.步驟:先將分光光度計暖機至少 10 分鍾以穩定光源，利用 260/280 nm 波長之可見光測量。先取石英管
注入 1000 μl DEPC-treat H2O 做為 blank 扣除背景值，取 1 μl Total RNA 與 999 μl DEPC-treat H2O 混合
均勻後，放入 Spectrophotometer 測量。計算公式： OD260 × 40 × 1000 = Total RNA (μg/ml)
6.3.反轉錄反應 (Reverse transcription)
6.3.1 步驟:取定量 Total RNA 來進行單管的 RT 反應。在 200 μl PCR 微量離心管中加入下列試劑: dNTP (10
mM)，Oligo-dT，與 DEPC-treatment H2O，以 65℃加熱 5 分鐘後置於冰上。再依序加入 10X RT buffer，
MgCl2 (25 mM)，DTT (0.1 M)，與 RNase inhibitor，混合完全後以 42℃加熱 2 分鐘後置於冰上。最後加入
Reverse transcriptase (50 unit/μl)，混合完全後置入 PCR machine 進行反轉錄反應。當反轉錄反應完成後，
再加入 E.coli RNase H 在 37℃加熱 20 分鐘，使之與單股 cDNA 結合的 RNA 分解，避免干擾後續聚合酶鏈
鎖反應。
6.4.同步定量聚合酶鏈反應 (Real-time polymerase chain reaction)
6.4.1.步驟:取 200 μl Optical grade PCR 微量離心管，依序加入下列試劑: 2X SYBR green I master mix，
forward primer (500 nM)，reverse primer (500 nM)，RT product 與 ddH2O 使體積達到 25 μl，混合完全後置
入 PCR machine 中，以 95℃加熱持續 1 分鐘使聚合酶活化，之後再以 95℃加熱 1 分鐘與 60℃加熱 1 分鐘
共 40 個循環之同步定量聚合酶鏈鎖反應。
7. 胰臟β-細胞 Aldose reductase、Sorbitol dehydrogenase、glyoxalase I 的活性及其基因表現。
7.1.醛酸還原酶(Aldose reductase)活性
7.1.1 原理：採用 Animesh 等人於 1997 所建立的方法，以 D-Glucose 當反應物，醛酸還原酶利用 Glucose
與 NADPH 作用生成山梨醇(Sorbitol)，於分光光度計 OD340nm 波長測得 NADPH 減少速度，間接求出樣
品中醛酸還原酶的活性。
7.1.2.步驟：取 1ml Reaction Buffer( 0.4 M lithium sulfate ， 10 mM DL-glyceraldehde，0.1 mM NADPH，溶
於 50 mM 磷酸鉀緩衝溶液，PH=6.0)，加入 0.1 ml 樣品，在 25℃下混合均勻反應後，在 OD340nm 下測
得樣品在 1 分鐘內吸光值的變化，濃度表示方式為 nmole NADPH/min/mg protein。
7.1.3.計算：
〔(樣品斜率-Blank 斜率)÷6.22(nmol NADPH)×106］/樣品量×mg/dl 蛋白質濃度
7.2. 山梨醇去氫酶(Sorbitol dehydrogenase)活性
7.2.1.原理：採用 Gerlach 等人於 1974 所建立的方法，Sorbitol dehydrogenase 活性分析是以 D-Fructose 當
反應物，此測定是利用 D-Fructose 與 NADH 作用生成山梨醇(Sorbitol)，利用分光光度計在 OD340nm 下測的 NADH 減少量，就可間接求出樣品中山梨醇脫氫酶(Sorbitol dehydrogenase)的活性。
7.2.2.步驟：取 3ml Reaction Buffer( 100mM Triethanolamine Buffer，1.1M D-Fructose，12.8mM ß-NADH，溶
於二次水中)，加入 0.1 ml 樣品，在 25℃下混合均勻反應後，在 OD340nm 下測得樣品在 5 分鐘內吸光值
的變化，濃度表示方式為 nmole /min/mg protein。
7.2.3.計算：
〔(樣品斜率-Blank 斜率)÷6.22(nmol NADH)×106］/樣品量×mg/dl 蛋白質濃度
7.3. 乙二醛酶(glyoxalase I)活性
7.3.1.原理：採用 Franky 等人於 2001 所建立的方法，乙二醛酶(GlO I)活性分析是以 Methylglyoxal(MG)當
反應物，乙二醛酶(GlO I)利用 Methylglyoxal(MG)與 Glutathion(GSH)作用生成 S-lactoyl-glutathione，利用分
光光度計於 OD240nm 下測的 S-lactoyl-glutathione 增加速度，可間接求出樣品中乙二醛酶(GlO I)的活性。
7.3.2.步驟：取 1ml Reaction Buffer( 2mM MG，2Mm GSH，溶於 50 mM 磷酸鈉緩衝溶液，PH=6.6)，加入
0.1 ml 樣品，在 20℃下混合均勻反應後，在 OD240nm 下測得樣品在 3 分鐘內吸光值的變化，濃度表示方
式為 umole /min/mg protein。
7.3.3.計算：
(樣品斜率-Blank 斜率)/3 分鐘/樣品量×mg/dl 蛋白質濃度
7.4. 胰臟β-細胞 Aldose reductase、Sorbitol dehydrogenase、glyoxalase I 基因表現
方法同前述 6.1 Total RNA 的萃取、6.2 RNA 定量、6.3 反轉錄反應 (Reverse transcription)、6.4 同步定量聚
合酶鏈反應 (Real-time polymerase chain reaction)。
8. 胰臟β-細胞中 fructose 及 CML 之含量。
8.1.fructose 含量
8.1.1.步驟：使用購自 BioVision 的 Fructose Assay Kit 分析，分別取 50μl 的樣品至 well，接著每個 well 加
入 50μl 反應的 reagent(含 OxiRed probe、enzyme mix、fructose converting enzyme)，於 37℃下靜置反應 1
小時後，利用分光光譜儀測波長 570nm 的吸光值。代入公式求得 fructose 含量
8.2.CML 含量
8.2.1 步驟：使用購自 CircuLex 的 N-ε- (Carboxymethyl) lysine ELISA Kit 分析，分別取 50μl 的樣品至 well，
接著每個 well 加入 anti-CML-adduct monoclonal Ab 室溫反應 1 小時，再加入含過氧化氫酶的抗體反應 1 小
時後，利用 ELISA Reader 測 450nm 的吸光值。代入公式求得之。
二、動物實驗
先前研究指出代謝症候群最終會導致第 2 型糖尿病與心血管疾病的發生(30)。所以站在預防的觀點，如果能有效預防代謝症候群的發生，是否也能有效延緩及預防第 2 型糖尿病與心血管疾病的發生。在目前
許多對抗代謝症候群的策略是透過有效降低代謝的壓力（包括：高血糖及胰島素阻抗）來達到對代謝症候
群的緩解作用。而在先前本實驗室以 STZ 誘發糖尿病小鼠的模式中，已發現飲食中添加了鯽魚複方製劑可
以有效下降血漿中 TG 的含量，並使得胰島素的敏感性增加。而飲食中添加了鯽魚複方製劑也可以幫助糖
尿病小鼠的血糖控制及改善血脂的控制不良。因此假設鯽魚複方製劑中是否可能含有可活化過氧化小體增
生活化受器（PPAR）的成分（ligands），來使得促進體內脂質的代謝利用，進而達到降血脂及降血糖的效
果，但此推論仍需進一步的實驗加以證實。而且在我們的預實驗中也發現，以高脂飲食誘發肥胖老鼠中，
其肝臟中 TG 合成有明顯增加、副睪脂肪之形成量亦明顯增加，而胰島素阻抗指數也明顯上昇，但在餵食
鯽魚複方製劑 4 週後有明顯緩解的趨勢(preliminary data Figure.1-3)。因此其所帶動之體內的變化相當值得
我們進一步深入探討。所以本次研究之另外一個重點就是想要利用高脂飲食模式誘發代謝症候群的發生來
進一步觀察鯽魚複方製劑是否可以透過活化體內 PPAR 相關的路徑來促使體內脂質的代謝利用，並可以有
效降低腹部肥胖以達到進一步預防第 2 型糖尿病及心血管疾病等慢性併發症的發生。而且實驗中將以 PPAR
相關的促效劑（agonist）- thiazolidinediones(TZD) or rosiglitazone 作為對照組來證實 PPAR 相關的路徑的活
化情形是否參與其中。另一方面，在代謝過程中，脂肪組織與細胞會分泌一些活性分子包括 leptin、
adiponectin、resistin 等用以幫助調節食物攝取、胰島素敏感、能量代謝及血管系統中的微環境。而另外也
有一些分子如：tumor necrosis factor alpha (TNF-a)、interleukin-6 (IL-6)及 monocyte chemoattractant protein-1
(MCP-1)則與肥胖所導致的發炎與致病過程有關。在 Kadowaki et al.,2006 的研究中指出，adiponectin 可能
可以藉由提高骨骼肌中 IRS-1 的表現來促進胰島素敏感的敏感性(31)。流行病學的研究亦指出 adiponectin
其血漿濃度在肥胖、第二型糖尿病、心血管疾病、血脂異常、高血壓以及代謝症候群患者都有明顯較低的
現象，顯示 adiponectin 在人體的能量代謝上扮演重要角色，將進一步探討(32)。而 leptin 的生理角色則是
與中樞神經系統的溝通有關，缺乏 leptin 將會導致食慾增加及進食量的增加，導致病態型肥胖的發生(33)。
先前研究也指出 resistin 可能與體內脂肪含量增加所導致的胰島素阻抗有關(34)。目前許多抗慢性病的策略
就是利用存在於植物或中草藥中的植物化學成分(phytochemicals)作為抗慢性發炎的治療方針(35,36)。所以
在本研究中的第 2 部份將進一步探討由脂肪組織所分泌的相關激素 leptin、adiponectin、resistin 所扮演的角
色及其在高脂飲食下的變化及影響，是否可以作為治療或預防代謝症候群發生的途徑，且透過鯽魚複方製
劑的給予是否可以下降或回復高脂飲食所造成的不良影響。
§ 研究方法
本研究將以 60%高脂飲食餵食 Balb/c 小鼠經 8 週後誘導其肥胖，並產生代謝症候群的症狀。再分別餵
食鯽魚複方製劑及 Statin 降膽固醇藥物經 8 週後觀察其下降或回復高脂飲食所造成的不良影響（治療作
用）。另一組則是將 Balb/c 小白鼠餵食高脂飲食同時合併鯽魚複方製劑經 8 週後，觀察高脂飲食合併餵食
鯽魚複方製劑對於預防高脂飲食造成肥胖之作用（預防作用）。
§ 測定之項目
1. 小鼠飲食量、飲水量及體重變化。
每天定時餵食並紀錄飲食量、飲水量，每週定期紀錄體重變化。
2. 小鼠體內臟器重及內臟脂肪重量。
老鼠犧牲後，取肝臟、腎臟、脂肪組織，秤重後紀錄，並使用無菌 0.9% 食鹽水清洗臟器後，於-80℃儲存。
3. 小鼠血中之血糖值、Insulin 含量
每週定期抽取小鼠尾靜脈血液，測量其血糖值。並於犧牲之時間點，採血測 Insulin 含量。
4. 採用 Matthews 等人於 1985 年提出以 HOMA-IR 的方法，利用空腹血糖值、胰島素值導入數學公式，來
間接定義量化胰島素阻抗性，數值越大代表胰島素阻抗性越大。
計算：
禁食血糖值(mmol/L) × 禁食血清胰島素(μU/L)
22.5
5. 小鼠葡萄糖耐量測試(OGTT)。
在空腹 4 小時以上之後，以管灌（2g/kg）方式給予實驗動物葡萄糖，然後分別在給糖前 0 分鐘與給糖後的
30、60、90 和 120 分鐘採血測定血糖值，觀察血糖濃度恢復到基礎線情形。
6. 小鼠血中及肝臟中 TG(三酸甘油脂)、TC(總膽固醇)、LDL(低密度脂蛋白)及 HDL(高密度脂蛋白)的含
量。
6.1. TG 測定
6.1.1.原理：脂解酶(Lipase)將三酸甘油脂水解成甘油及脂肪酸，甘油經由甘油激酶(GK)，ATP 作用下產生
glycerol-3-phosphate 及 ADP，glycerol-3-phosphate 再經 GPO 產生過氧化氫，在過氧化酶(POD)催化下，與
4-aminophenazone 及 4-chlorophenol 氧化成 quinoneimine 紅紫色物。
6.1.2.步驟：將 5μl 的血漿與肝臟均質液及標準品加入含有反應試劑的溶液中，混合均勻，在 37℃恆溫培
養箱中反應 5 分鐘，於波長 OD500nm 吸光值下，測定三酸甘油酯濃度。
計算：三酸甘油酯濃度(mg/dl)＝(樣品吸光值/標準品吸光值) x 200 6.2.TC 測定
6.2.1.原理：先以膽固醇酯水解酶(Cholerterol esterase)，將膽固醇酯水解成游離膽固醇，再利用膽固醇氧化
酶(Cholesterol oxidase:CHOD)氧化膽固醇產生過氧化氫，接著再過氧化酶(POD)催化下，4-aminoantipyrine
及 phenol 氧化成 quinoneimine 紅紫色物。
6.2.2.步驟：將 5μl 的心血漿與肝臟均質液及標準品加入含有反應試劑的溶液中，混合均勻，在 37℃恆溫
培養箱中反應 5 分鐘，於波長 OD500nm 吸光值下，測定膽固醇濃度。
計算：膽固醇濃度(mg/dl)＝(樣品吸光值/標準品吸光值) x 200
3.LDL 及 HDL 測定
plasma 及肝臟均質液中的 LDL、HDL 含量分析將以商業套組進行分析。
7. 小鼠體內的總抗氧化能力測試。
7.1.原理：2,2’-azinobis [3-ethylbenzthiaoline]-6-sulfonic acid diammonium salt (ABTS)在水溶液中可經 H2O2
與 Peroxidase 反應後，形成穩定的 ABTS+自由基(藍綠色)。若有清除 ABTS+自由基能力，使得 ABTS+還
原成 ABTS，溶液顏色愈淡，表示抗氧化能力越大
7.2.步驟：參考 Miller et. al(1996)方法加以修改，將 0.5 ml peroxidase (44 U/ml)、0.5 ml 2,2’-azinobis
[3-ethylbenzthiaoline]-6-sulfonic acid(ABTS；750μM)和 0.5ml H2O2(500μM)加入 3ml DDW 後混合均勻
後，靜置 overnight。再加入 0.5ml 標準品或樣品，反應 6 分鐘後，測波長 734nm 吸光值。以不同濃度 Trolox
清除 ABTS+能力，作為預測 sample 的抗氧化能力。
8. 小鼠血中 leptin、adiponectin、resistin 的含量
8.1.原理：leptin、adiponectin、resistin 的含量分析將以商業套組進行分析分析方法係利用 ELISA 的原理，
用專一性抗體結合待測物，再加入受質 3,3`,5,5`- tetra-methyl-benzidine (TMB)，經 peroxidase 催化，使之呈
色，最後再加入 H2SO4 終止反應。
8.2.步驟：將 25μl 的血漿樣品加入含有 leptin、adiponectin、resistin 抗體的孔盤中，再加入 50μl 的 conjugate
solution，再室溫下使用 shaker 反應 2 小時，之後使用 wash buffer 清洗六次，再加入 peroxidase 的受質 TMB
200μl，反應 15 分鐘，最後加入 H2SO4 終止反應，以 ELISA reader 於波長 OD450nm 測得吸光值，計算濃
度。
9. 小鼠脂肪組織中發炎指標（TNF-α、IL-6）測試。
9.1.原理：使用商業套組進行分析，血清 TNF-α、IL-6 會接上已 coating 具 TNF-α、IL-6 特異性的多株抗
體，再加入抗 TNF-α、IL-6 的過氧化酶與其受質 TMB（tetramethylbenzidine）作為呈色劑，測吸光值後代
入標準曲線換算出 insulin 濃度。
9.2.步驟：在 96 孔盤中加入 25μl 的血清、標準品與每孔 50μl 的 Enzyme conjugate solution 反應 2 小時之
後，以 wash buffer 清洗 6 次，再加入 200μl 的 TMB 反應 15 分鐘後，加入 50μl stop solution，即可在 450
nm 下測得吸光值。最後將吸光值代入方程式可求得 TNF-α、IL-6 濃度，單位以μg/l 表示。
10. 小鼠肝臟及脂肪組織中 PPAR 活化的情形。
10.1.萃取核蛋白
10.1.1 步驟:將實驗終點餵食含不同濃度鯽魚複方製劑的小鼠犧牲，取得肝臟及脂肪組織。然後以 PBS 進行
均質，離心 1200xg 10 min 去上清液，加入含有 phosphatase inhibitor 的 PBS 重新混懸沈澱 pellet，再次離心，
以 hypotonic buffer 輕輕混懸 pellet 並轉至 eppendorf，冰浴 15 分鐘，再加入 detergent 高速 vortex 10 秒，之
後 14000xg 4℃; 30 sec 超高速離心，收集 pellet 進一步萃取核蛋白。以 lysis buffer 再次混懸 pellet，放入水
平振盪器 100xg 30 分鐘，最後超高速離心 14000xg 10 min，取上清液至新 eppendorf，均分或保存於-80℃
直至實驗。
10.2.轉錄因子 PPAR 活化測試
10.2.1.步驟:先行定量萃得的核蛋白，取一定量溶於 lysis buffer 中，加入預先固定化 PPAR αand γconsensus
oligonucleotide 的 well 中，在水平振盪器中輕輕振盪 1 hr，再以 washing buffer 清洗 3 次，之後再依序加入
1°及 2°抗體，最後加入呈色劑反應 5 min 後終止反應。在波長 450 nm 測吸光值。
結果與討論、（含結論與建議 、 ）
一、細胞實驗
1. 在 H2O2刺激下，觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)之存活與生長影響
利用 MTT 法觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)之存活影響，RIN-m5F 細胞
在處理 70µM H2O2刺激下，存活率明顯減少(**p＜0.01)，但如果加入鯽魚萃取物(CACF)10µg/ml(##p＜0.01)
及 50µg/ml(#p＜0.05)後都有存活率明顯回升，證實鯽魚萃取物(CACF)具有保護胰島β細胞之潛力(Fig.1A)。
接著進一步分析鯽魚萃取物(CACF)的保護作用是經由何種途徑來影響細胞生長，以 DAPI 染色法觀察細胞
凋亡的情形，由 Fig.1B 結果發現，RIN-m5F 細胞在處理 70µM H2O2刺激下，凋亡細胞明顯增加(*p＜0.05)，
加入鯽魚萃取物(CACF)10、20 及 50µg/ml 後都有明顯減少細胞凋亡情形，且呈現劑量依賴現象，證實鯽魚
萃取物(CACF)具有保護胰島β細胞對抗 H2O2 刺激下所導致細胞凋亡。此外，當細胞受到外來刺激下，也可
能透過細胞自噬作用來使細胞死亡，我們以 AVO 染色法觀察細胞自噬作用，Fig.1C 結果發現 H2O2 刺激可
使 RIN-m5F 細胞增加約 40%細胞自噬作用，但處理鯽魚萃取物(CACF)10、20 及 50µg/ml 後無顯著減少細
胞自噬情形，因此證明鯽魚萃取物可能經由抑制 H2O2刺激下所導致細胞凋亡來保護胰島β細胞。
2. 在 H2O2刺激下，觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)胰島素分泌之影響
利用胰島素的釋放及含量測試(GSIS)，觀察在 H2O2 刺激下，鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤
細胞(RIN-m5F) 胰島素分泌之影響。RIN-m5F 細胞在處理 70µM H2O2刺激下，加入鯽魚萃取物(CACF)10、
20 及 50µg/ml 後，再以 2.8mM glucose 刺激 1 小時候，偵測胰島細胞釋放胰島素的情形，由 Fig.2 結果發現，
70µM H2O2 刺激可使細胞胰島素分泌減少，但隨著加入鯽魚萃取物(CACF)10、20 及 50µg/ml 下，能使胰島
素分泌逐漸回升，證明鯽魚萃取物可能經由保護胰島β細胞使胰島素分泌增加。
3. 在 H2O2刺激下，觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)氧化壓力之影響
利用流式細胞儀分析，觀察在 H2O2刺激下，鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)內 ROS 壓力之影響。RIN-m5F 細胞在處理 70µM H2O2刺激下，加入鯽魚萃取物(CACF)10、20 及 50µg/ml
後，再 DCFH-DA 染劑處理 1 小時候，偵測胰島細胞內 ROS 含量的情形，由 Fig.3 結果發現，70µM H2O2
刺激可使細胞 ROS 增加 60.5%，加入鯽魚萃取物(CACF)10、20 及 50µg/ml 下，使 ROS 些微減低為 59.63%、
53.75%及 55.36%，證明鯽魚萃取物可些微降低細胞內 ROS 含量來減少 ROS 所造成細胞傷害。
4. 在 H2O2刺激下，觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)存活與胰島素分泌之分子
機制分析
因上述實驗以觀察到觀察鯽魚萃取物(CACF)可以保護老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)對抗 H2O2所造
成細胞存活並進而影響胰島素分泌情形，因此進一步利用 Western blotting 方法，分析與細胞存活有關 PI3K
與 NF-κB 的蛋白質表現，由 Fig. 4 中發現，加入鯽魚萃取物(CACF)10µg/ml 可增加 PI3K 蛋白表現(#p＜
0.05)，而加入 20µg/ml CACF 可增加 NF-κB 蛋白表現(#p＜0.05)。另外與胰島素分泌有關的 IRS-2 蛋白分析
也發現，加入鯽魚萃取物(CACF)10、20 及 50µg/ml 後都有明顯增加 IRS-2 蛋白表現情形，且呈現劑量依賴
現象。證實鯽魚萃取物(CACF)具有保護胰島β細胞對抗 H2O2 刺激下所導致細胞凋亡可能是經由增加 PI3K
與 NF-κB 的細胞存活路徑與促進 IRS-2 蛋白表現來增加胰島素分泌。(Fig.4)
5. 在 H2O2刺激下，觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)胰島素分泌相關基因表現
為進一步了解鯽魚萃取物(CACF)影響老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)胰島素分泌情形，因此進一步利
用 Real-time PCR 方法，分析與胰島素分泌有關的基因，包含 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2 基因表現。
由 Fig.5 結果發現，加入鯽魚萃取物(CACF)後有不同程度增加 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2 基因表現情
形。證實鯽魚萃取物(CACF)具有增加胰島β細胞 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2 基因表現來增加胰島素分
泌與血糖的調控。(Fig.5)
二、動物實驗
經由細胞實驗發現，鯽魚萃取物(CACF)具有保護胰島β細胞對抗 H2O2刺激下所導致細胞凋亡、增加胰
島素分泌相關基因表現，因此進一步利用動物實驗證實鯽魚萃取物(CACF)具有改善小鼠代謝徵候群之能
力。
1. 在給予複方鯽魚萃取物 8 週後測試口服葡萄糖耐量試驗
口服葡萄糖耐量試驗(Oral Glucose Tolerance Test，OGTT)對糖尿病診斷具有很大的價值(41)。正常人口
服葡萄糖後幾乎全部會被腸道吸收，使血糖迅速上升，這時胰島素分泌，可促進組織對葡萄糖的利用；約
後 30～60 分鐘血中血糖濃度達到高峰，接著迅速下降，在 2 小時左右下降到接近正常水準。在給予複方鯽
魚萃取物後，測試 OGTT，將各組的第 0 分鐘調為相同的起始點(100％)，在 30 分鐘時各組的血糖上升情
況為控制組 242％，高脂+STZ 組 238％，高脂+STZ+低鯽魚組 201％，高脂+STZ+高鯽魚組 209％，高脂
+STZ+Statin 組 165％，高脂組 281％。從 30 分鐘的結果中可觀察到在添加低劑量鯽魚、高劑量鯽魚及 Statin
組別分別降為誘導組的 84％、87％、69％。從結果中可得知，複方鯽魚萃取物及 Statin 藥物有助於血糖的
平穩。(Fig.6A)
2. 利用高脂飲食及 STZ 藥誘發糖尿病後給予低劑量及高劑量複方鯽魚萃取物八週後犧牲後分析血糖的影響，在成功誘導小鼠為糖尿病鼠後，給予複方鯽魚萃取物及 Statin 藥物八週後犧牲，在犧牲時使用血糖試
紙測得血糖值為控制組 50mg/dl，高脂+STZ 組 321mg/dl，高脂+STZ+低劑量鯽魚組 132mg/dl，高脂+STZ+
高劑量鯽魚組 142mg/dl，高脂+STZ+ Statin 組 194mg/dl，高脂組 80mg/dl(Fig. 6B)，在高脂+STZ 組及高脂
組顯著高於控制組，低劑量鯽魚、高劑量鯽魚及 Statin 藥物組顯著低於高脂+STZ 組。從結果中，可得知在
添加複方鯽魚萃取物及 Statin 藥物有助於血糖的平穩。取小鼠之血清測得胰島素含量為控制組 1.5ug/L，高
脂+STZ 組 1.6ug/L，高脂+STZ+低劑量鯽魚組 1.3ug/L，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 2.8ug/L，高脂+STZ+ Statin
組 2.4ug/L，高脂組 2.4ug/L(Fig. 6C)。利用 Matthews 等人提出以 HOMA-IR 來測量胰島素阻抗的方法(42)，
值越高罹患代謝症候群機率也越高，在各組計算出的 HOMA 值為控制組 3.1, 高脂+STZ 組 24.6，高脂
+STZ+低劑量鯽魚組 8.4，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 15.5，高脂+STZ+ Statin 19.2，高脂組 9(Fig.6D)，在
結果中可得知在添加複方鯽魚萃取物後相對於高脂+STZ 組有顯著下降，說明添加複方鯽魚萃取物可減少
代謝症候群的發生。
3. 利用高脂飲食及打 STZ 藥誘發成功後給予低劑量及高劑量複方鯽魚萃取物八週後犧牲後取得血清分析
發炎因子
取得血清後以 ELISA KIT 分析 TNF-α、IL-1β、IL-6。由 Fig.7 結果顯示，TNF-α的結果為控制組
26.4pg/ml，高脂+STZ 組 34.8pg/ml，高脂+STZ+低劑量鯽魚組 26.2pg/ml，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 13pg/ml，
高脂+STZ+Statin 組 30pg/ml，高脂組 25.4pg/ml。IL-1β的結果為控制組 31.7pg/ml，高脂+STZ 組 90pg/ml，
高脂+STZ+低劑量鯽魚組 51.3pg/ml，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 66.6pg/ml，高脂+STZ+Statin 組 39.1pg/ml，
高脂組 62.6pg/ml。 IL-6 的結果為控制組 52.5pg/ml，高脂+STZ 組 83pg/ml，高脂+STZ+低劑量鯽魚組
38pg/ml，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 61.8pg/ml，高脂+STZ+Statin 組 76pg/ml，高脂組 pg/ml。
4. 利用高脂飲食及打 STZ 藥誘發成功後給予低劑量及高劑量複方鯽魚萃取物八週後犧牲後取肝臟分析
在小鼠犧牲後取肝做 Hematoxylin and eosin stain( HE stain)在肝的臟的染色中，以靜脈竇為中心 100 的
倍率拍攝，旁邊小白色小泡為脂肪的堆積(Fig.8A)。在結果中初步觀察發現高脂+STZ 組的有脂肪肝的現象，
低鯽魚及高鯽魚組別結果脂肪的堆積量明顯較高脂+STZ 組少，高脂+STZ+Statin 組有脂肪的堆積，但相較
於高脂+STZ 組少，可說明在低劑量的鯽魚組別中，較有減少高脂飲食所引起的脂肪肝現象。TBARS 是在
測試其脂質過氧化的程度 (可解釋為每多少單位的蛋白中其脂質過氧化的程度) ，因此在氧化壓力存在下
會升高，在本實驗結果中顯示控制組 0.17uM，高脂+STZ 組 0.3uM，高脂+STZ+低劑量鯽魚組 0.17uM，高
脂+STZ+高劑量鯽魚組 0.28uM，高脂+STZ+Statin 組 0.16 uM，高脂組 0.2 uM (Fig. 9A)，高脂+STZ 為控制
組 175％，有顯著差異，在低劑量鯽魚組為高脂+STZ 組的 56％，有顯著下降。GSH(Glutathione)為體內的
一種抗氧化劑，可清除自由基，在 GSH 的結果中顯示控制組 152.9uM，高脂+STZ 組 185.9uM，高脂+STZ+
低劑量鯽魚組 174.2uM，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 151.8uM，高脂+STZ+Statin 組 196.2uM，高脂組 144.9uM
(Fig. 9B)。麩胱甘肽過氧化酵素 (glutathione peroxidase；GPx)是一種抗氧化酵素，在本實驗 GPx 的結果中
顯示控制組 88.5，高脂+STZ 組 108.1，高脂+STZ+低劑量鯽魚組 274.5，高脂+STZ+高劑量鯽魚組 415.7，
高脂+STZ+Statin 組 136.8，高脂組 127.7(Fig. 9C)。在低劑量鯽魚及高劑量劑魚結果中顯示有顯著高於高脂+STZ 組，從結果中得知，給予複方鯽魚萃取物可提高動物體內的抗氧化能力。
5. 利用高脂飲食及打 STZ 藥誘發成功後給予低劑量及高劑量複方鯽魚萃取物八週後犧牲後取腎臟分析
在小鼠犧牲後取腎臟做 Hematoxylin and eosin stain( HE stain)，以 100 的倍率拍攝，觀察腎絲球的損傷
情況，在高脂+STZ 組中看到在腎絲球中心沒有縫隙為發炎狀況，而在低劑量的鯽魚萃取物中，發炎的狀
況較為平緩，但餵食高劑量鯽魚組沒有減緩發炎的狀況(Fig 10A)。Fig.10B 中收集尿液分析尿蛋白 albumin
的含量，利用 SDS-PAGE 分析法可觀察高脂+STZ 組為控制組的 121％，低劑量鯽魚組為高脂+STZ 組的 83
％，有顯著的下降，高劑量鯽魚為高脂+STZ 組的 101％，高脂+STZ+Statin 組為高脂+STZ 組的 83％，有
顯著降低，高脂組為高脂+STZ 組的 70％，也有顯著降低。以上結果顯示，在餵食低劑量鯽魚複方後，可
以保護腎臟。
6. 利用高脂飲食及打 STZ 藥誘發成功後給予低劑量及高劑量複方鯽魚萃取物八週後犧牲後取脂肪分析
脂肪細胞均質完後離心取上清液做 westren bloting 分析 PPARγ、PPARα、Fatty acid synthase 等蛋白，
在先前的研究中指出 PPARγ、PPARα可抑制發炎因子的產生，而本次實驗結果顯示 PPARγ在低鯽魚、
高鯽魚的組別中高於高脂+STZ 組，為高脂+STZ 組的 200％、157％，皆有上升的趨勢但未達顯著差異。在
PPARα中低鯽魚、高鯽魚及 Statin 的組別中高於高脂+STZ 組，為高脂+STZ 組的 210％、163％、165％。
Fatty acid synthase 為脂肪酸合成的主要蛋白，合成脂肪酸後再合成三酸甘油脂，在 westren bloting 分析結
果中顯示在低鯽魚、高鯽魚、Statin 及高脂組低於高脂+STZ 組，分別為高脂+STZ 組的 90％、67％、48％、
66％，但無顯著差異。(Fig.11)
7. 利用高脂飲食及打 STZ 藥誘發成功後給予低劑量及高劑量複方鯽魚萃取物八週後犧牲後取肝臟 Westren
bloting 分析
肝臟細胞均質完後離心取上清液做 westren bloting 分析 HMG CoA reductase、PPARγ、PPARα、Fatty acid
synthase 等蛋白。HMG CoA reductase 為膽固醇合成的主要蛋白，在實驗結果中顯示低鯽魚、高鯽魚、Statin
組皆有下降但未達顯著差異，其低鯽魚、高鯽魚、Statin、為高脂+STZ 組的 88％、82％、92％。在先前的
研究中指出 PPARγ、PPARα可抑制發炎因子的產生，而本次實驗結果顯示 PPARγ在低鯽魚、高鯽魚及
Statin 的組別為高脂+STZ 組的 115％、116％、110％，但未達顯著差異。在 PPARα的結果中顯示低鯽魚、
高鯽魚及 Statin 的組別為高脂+STZ 組的 109％、98％、87％，在高鯽魚及 Statin 組別中相對於高脂+STZ
組有下降，但未達顯著差異。Fatty aicd synthase 為主要合成脂肪酸的蛋白，脂肪酸再合成三酸甘油脂，本
次實驗結果顯示 Fatty aicd synthase 在低鯽魚、高鯽魚及 Statin 的組別為高脂+STZ 組的 170％、250％、226
％。 (Fig.12)
三、綜合討論：
本實驗為主要探討複方鯽魚萃取物對代謝症候群小鼠的影響。複方鯽魚萃取物是以鯽魚、山藥、枸杞、
地黃等中藥材燉煮濃縮製造而成。在先前的研究中，指出中草藥中的山藥可以改善胰島素抗性(37)，枸杞
中的多醣成份可抗氧化(38)，而地黃可對減緩高血糖的狀況(39)。因此，本研究先由細胞實驗切入，在 H2O2
刺激下，觀察鯽魚萃取物(CACF)對於老鼠胰島β細胞瘤細胞(RIN-m5F)之存活與生長影響，證實鯽魚萃取物(CACF)具有保護胰島β細胞之潛力(Fig.1A)，是經由保護胰島β細胞對抗 H2O2 刺激下所導致細胞凋亡
(Fig.1B) ，進一步分析分子機制發現，鯽魚萃取物(CACF)保護胰島β細胞對抗 H2O2 刺激下所導致細胞凋亡
可能是經由增加 PI3K 、NF-κB 與 IRS-2 的蛋白表現活化細胞存活路徑(Fig.4)。由 Fig.2 結果發現，鯽魚萃
取物(CACF)能使胰島素分泌逐漸回升，證明鯽魚萃取物可能經由保護胰島β細胞使胰島素分泌增加，進一
步利用 Real-time PCR 方法，分析與胰島素分泌有關的基因，包含 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2 基因表
現。由 Fig.5 結果發現，加入鯽魚萃取物(CACF)後有不同程度增加 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2 基因表
現情形。證實鯽魚萃取物(CACF)具有增加胰島β細胞 PDX-1、GK、GLUT-2 與 IRS-2 基因表現來增加胰島
素分泌與血糖的調控。
根據 Stolar 等人研究指出良好的血糖控制可延緩糖尿病併發症的發生(43), 在餵食複方鯽魚萃取物後，
血糖有顯著下降 (Fig.6)。本實驗參考 Matthews 等人提出以 HOMA-IR 來測量胰島素阻抗的方法(42)。
HOMA-IR 應用在在糖尿病或非糖病族群呈現與胰島素阻抗正相關(44-47), 值越高代表胰島素阻抗程度也
越高，在我們的實驗結果中發現在給予複方鯽魚萃取物的組別中 HOMA-IR 有顯著的下降 (Fig.6), 表示複
方鯽魚萃取物可減少胰島素的抗性及減少代謝症候群發生的機率。
TZD 這類藥物被稱為胰島素致敏劑（Insulin Sensitizers）其可藉由活化細胞核表面的 PPARγ接受器，
增加脂肪細胞攝入游離脂肪酸及肌肉細胞攝入葡萄糖，改善胰島素阻抗的情形，增加血糖的穩定性，在先
前的研究也指出 TZD 藥物主要活化 PPARγ使血糖較為穩定(48)，在我們的實驗結果中也發現在有添加複
方鯽魚萃取物組別中的肝臟及脂肪細胞中 PPARγ的量雖然沒有到顯著差異，但有增加的趨勢 (Fig.11,
12)。PPARγ除了可以增加血糖的穩定外，在其他的研究中也指出 PPARγ可以抑制發炎因子的產生(如：
TNF-α、IL-1β、IL-6)進而抑制發炎反應(49)。先前的研究也指出 PPARα可保護肝臟免受肥胖引起的發炎
疾病(50)，在肝及脂肪組織 Westren blot 的結果中可看到雖然未達顯著差異，但 PPAR 的量皆有增加 (Fig.11,
12)。PPARγ及 PPARα兩者皆可抑制發炎的現象，對照發炎因子的結果可看到血清的 TNF-α在添加複方
鯽魚萃取物後都有下降的趨勢，其中在高劑量複方鯽魚萃取物中是有顯著的下降，在血清的 IL-1β雖然沒
有顯著差異，但在高、低劑量中都有下降的趨勢，在血清 IL-6 的結果中，低劑量有顯著差異(Fig.7)。
在本實驗結果中可推斷在餵食鯽魚萃取物可降低體內發炎因(TNF-α、IL-1β、IL-6)的增加，減緩了發
炎狀況而使胰島素的敏感性增加，進而減少胰島素的抗性，緩和糖尿病患者的高血糖狀況，增加血糖的穩
定性。
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